Mass Spectrometry Application Strategies of Dried Blood Spots Analysis

El análisis de manchas de sangre seca (DBS) es una tecnología de análisis bien conocida, cuyas primeras aplicaciones de rutina se remontan a la década de 1960. Los avances en los instrumentos de espectrometría de masas durante el siglo pasado, permitieron alcanzar la sensibilidad necesaria para abrir nuevos mercados. Sin embargo, algunas incertidumbres y la falta de comprensión de los métodos han impedido hasta el momento que la tecnología tenga una amplia aceptación en el mercado.En esta tesis doctoral se han desarrollado y validado diversas técnicas, condiciones y flujos de trabajo de análisis DBS, que demuestran la viabilidad y el potencial de aplicación de la tecnología DBS-LC-MS.Se han desarrollado métodos avanzados para su aplicación en el campo de la pediatría neonatal, en particular la prueba del talón en recién nacidos, donde se ha ampliado y estandarizado el panel de análisis.También se han investigado nuevos campos de aplicación, como la vigilancia de medicamentos terapéuticos y la toxicología forense. Se describe la aplicación de la farmacovigilancia remota de antirretrovirales en regiones de escasos recursos y se presentan nuevos enfoques analíticos para la vigilancia del abuso de alcohol. Finalmente, en esta tesis se ha introducido un método innovador con el que se pueden detectar más de 1.200 drogas ilícitas a partir de una sola gota de sangre.La investigación científica realizada se presenta en forma de compendio de publicaciones (6), que son incluidas en esta Memoria. Se adjuntan a modo de apéndice otros dos trabajos del candidato que no constan oficialmente en dicho compendio. Todos los trabajos constituyen una unidad temática coherente sobre la técnica de la DBS y su acoplamiento a la espectrometría de masas.This doctoral thesis is a compendium of dried blood spot (DBS) applications in the fields of newborn screening, forensic toxicology and therapeutic drug monitoring. DBS is a well-known analysis technology, which first routine applications date back to the 1960s. Advancements in mass spectrometry instruments during the last century, enabled to reach the required sensitivity to open up new markets. Some uncertainties and missing method understanding remain and this is holding back the technology from wide spread market acceptance. For the general scientific acceptance of this technology, several methods have been developed and validated within this work. Advanced methods for the field of newborn screening were developed, where the analysis panel has been extended and standardized. Goal of the first study was to transfer the amino acids and acyl carnitines analysis onto the automated DBS-MS 500 platform. Also, a steroid panel of 17OHP, cortisol and androstenedione was defined to exclude the 17OHP from the immune assay panel and to transfer this as well onto the fully automated DBS-LC-MS/MS. The conventional 17OHP enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based on a manually punched DBS disc leads to a high percentage of false positive. First, cortisol increases when the babies are stressed, which also leads to elevated 17OHP concentrations and secondly, the ELISA has significant cross reaction potential with steroid sulfate which can be monitored with androstenedione. Both, the amino acid and acyl carnitine detection plus the integration of a steroid panel into the DBS-LC-MS/MS workflow was successfully achieved [1]. Newborn screening panels are not unified across borders and sometimes even differ within countries and laboratories. The implementation of the fully automated DBS platform could be a good starting point of standardization and unification of those programs. Here, a method based on an official newborn screening kit was introduced within this thesis. The analysis takes only 2 minutes per sample; however it is limited to amino acids and acyl carnitines only. The DBS extract is directly guided to the mass spectrometer without any column. This is a well-known procedure in newborn screening and allows speeding up the process to its optimum [2]. Therapeutic drug monitoring, especially in remote and rural areas is another upcoming application field of DBS. Several methods have been supported and co-authored, whereas the first method focuses of the three antiretroviral drugs nevirapine, efavirenz and lopinavir. The study highlights the transportation advantages of DBS, without any biohazard labeling neither requiring cooling chains. DBS were drawn in Tanzania, Africa, and sent to Switzerland where the samples went through different climate zones. Nonetheless, the samples showed very good results and stability of the monitored drugs [3]. We ran a follow up study on some of the samples approximately one year after the publication, where still all analytes could be recovered in the same concentration as published. Also the DBS sampling itself was investigated in a rural area of Tanzania [4] and the technique proved to be suitable. Another therapeutic drug, where a more efficient sampling process is required for mass drug administration (MDA) campaigns, is Ivermectin. This drug lowers the incidence of river blindness and lymphatic filariasis infections. Further, recent studies demonstrated that Ivermectin is also active against several other parasites and even against certain mosquitoes. As one of these mosquitoes is Anopheles gambiae, the major vector of malaria in Africa, Ivermectin could be mass administered to fight malaria. In other words, the drug makes the human blood lethal for the Anopheles gambiae and therefore reduces the number of vectors in an area. Still, more safety data is required from a larger population. Here, an according fully automated DBS method has been developed and validated. In addition, a comparison study to plasma samples, stability and hematocrit impact has been studied [5]. In forensic toxicology, it was shown that Dried Matrix Spot (DMS) is a suitable technology for large scale DBS applications. A fully automated method, where either 1200 drugs can be screened from a DBS and a quantitative follow up method focusing on the 28 most abundant drugs of abuse, was developed. This was documented within two publications, where the first publication was a proof of concept study to determine if the detection limits can be reached using the DBS-LC-MS/MS methodology [6]. The second, follow up publication was a specific method development and implementation. More than 1200 illicit drugs can be screened from a single DBS or Dried Urine Spots (DUS) within 20 minutes per sample using a Forensic Toxicology Database. The criteria of bio-analytical method validation guidelines were fulfilled, and the method was transferred into a routine laboratory successfully [7]. Furthermore, the discovery of phosphatidylethanol (PEth) as direct alcohol marker prolonged the window of detection for alcohol consumption to several weeks. PEth proved to be instable during storage of liquid blood samples. By using DBS sampling, this biomarker can be stabilized due to the inactivation of enzymatic activity. Also, for PEth, a fully automated DBS-LC-MS/MS was established for the determination of the two most abundant PEth homologs in a range from 20–1500 ng/mL. Automated DBS card handling and online solid phase extraction LC-MS/MS permits baseline separation and detection of PEth 16:0/18:1 and PEth 16:0/18:2 within 7 minutes per sample [8]. The methods from the various fields of application were presented at several conferences as oral presentations and posters, showing their interest from the scientific blood analysis community.<br /

Aportación de la cromatografía en capa fina de alta eficacia acoplada a espectrometría de masas y de la fluorescencia de flavoenzimas a la lipidómica y a otros problemas del análisis de lípidos

La Lipidómica hace referencia a la disciplina de investigación basada en el análisis de las especies lipídicas, e incluye la identificación y cuantificación de los miles de especies moleculares de lípidos celulares en sistemas biológicos. Los avances en tecnología analítica, especialmente en Espectrometría de Masas (MS) han impulsado la investigación en Lipidómica y la del análisis de lípidos en matrices de interés industrial relacionadas con la alimentación y la bioenergía. Aunque la plataforma más utilizada es sin duda el acoplamiento con la Cromatografía Líquida de Alta Eficacia en Columna, con ionización de tipo electrospray, LC-MS (ESI), no hay un único esquema basado en MS que pueda cubrir la detección del lipidoma completo, debido a la diversidad de las estructuras moleculares existentes. En esta Tesis se ha evaluado la aportación de dos técnicas y se han desarrollado nuevas metodologías analíticas para el análisis de diferentes clases de lípidos en muestras complejas que proceden de matrices diferentes utilizando dos enfoques distintos.Por un lado, para el análisis de las especies moleculares individuales de diferentes clases de esfingolípidos (SL) en plasma humano, lípidos neutros (LN) y ácidos grasos (FA) en biodiésel, y fosfolípidos (PL) en extractos de membranas bacterianas y su complejo purificado, se ha llevado a cabo el desarrollo de la técnica de Cromatografía en Capa Fina de Alta Eficacia acoplada a técnicas tándem MS (HPTLC-MSn) y de alta resolución HRMS. Desde una misma placa cromatográfica se obtiene:• una separación en clases de lípidos• perfiles semicuantitativos dentro de cada clase de lípidos por ESI-MS • determinación estructural inequívoca y directa de los lípidos individuales y sus especies moleculares por tamden MS/HRMSSe demuestra que esta técnica tiene especial interés en la caracterización rápida de bandas diana en la zona deseada de la placa. La selectividad espacial proporcionada por la técnica la hace complementaria a LC-MS. Otras ventajas son alta capacidad de tratamiento de un elevado número de muestras simultáneamente, desarrollo paralelo de muestras y patrones y bajo coste relativo en tiempo y disolvente. Tradicionalmente el enfoque MS/MS no se había desarrollado en HPTLC debido a que la formación conjunta de especies sodiadas y protonadas complicaba la interpretación de los espectros. Los aductos de sodio de los espectros ESI-MS pueden ser fragmentados en modo ESI+ usando tecnologías de trampa de iones y cuadrupolo TOF. El sodio permanece como carga de los iones producto siendo este hecho útil para la identificación de las estructuras de los lípidos. Los espectros se obtienen de manera rápida, fiable y sencilla a partir de las bandas separadas en la placa mostrando buena intensidad y calidad.Por otro lado, buscando selectividad hacia un único analito se ha desarrollado una metodología analítica basada en la fluorescencia de las flavoenzimas, que permite la determinación de fosfolípidos que contienen colina, como la fosfatidilcolina (PC). Si sobre ella actúa la lipasa (PLC) se obtiene fosforilcolina (ChoP) que a su vez reacciona con la enzima fosfatasa alcalina (AP) obteniendo colina (Ch). PLC AP ChOxPC-------->ChoP--------->Ch--------->betaina+H2O2La enzima colina oxidasa (ChOx) es una flavoenzima que cambia sus propiedades ópticas durante su reacción con Ch, hecho que se puede utilizar para la determinación de PC o sus metabolitos sin la necesidad de añadir más reactivos que los involucrados en la reacción. En esta tesis esta metodología se aplica a la determinación de ChoP y Ch en muestras de leche infantil poniendo de manifiesto las posibilidades de la técnica:• dependiendo del interés se puede hacer la determinación secuencial o simultánea simplemente cambiando el orden de adición de los reactivos• puesto que la selectividad la aportan las reacciones enzimáticas el tratamiento de muestra es corto y sencillo.• la metodología se ha desarrollado en un lector de placas de pocillos por lo que es muy económico• las interferencias espectrales se evitan de forma sencilla modificando químicamente la enzima para trabajar a longitudes de onda adecuadas.• puesto que las enzimas se regeneran se pueden desarrollar sensores, para lo que se deben inmovilizar en los soportes adecuados. Se eligió un soporte basado en gel de acrilamida pudiéndose desarrollar un sensor tanto para colina como para fosfato de colina.<br /

Determinación de alcanos en productos de petróleo por HPTLC-Fluorescencia inducida

En este trabajo se ha desarrollado un método semicuantitativo para la determinación de Saturados en cuatro productos de petróleo por la técnica HPTLC-densitometría por fluorescencia inducida. Para ello, se optimizaron las condiciones de separación y detección de los Saturados.Se estudiaron tres tecnologías de separación diferentes: cámara vertical, cámara horizontal y AMD. En cuanto a condiciones de detección, se estudiaron la respuesta de alcanos individuales usando dos inductores de fluorescencia (berberina y primulina) a dos concentraciones diferentes. Además, se estudiaron las respuestas individuales de diferentes alcanos en el sistema para elegir un patrón mezcla de alcanos para el calibrado de los Saturados en las muestras, que se realizó mediante los métodos de adición estándar y patrón externo.Se discutirá la validez de la elección y los resultados obtenidos. En el caso del aceite de base, se compararán a dos valores de referencia obtenidos en dos laboratorios diferentes.<br /

Determinación de glicerofosfolípidos y esfingolípidos en muestras de interés biológico mediante Cromatografía en Capa Fina de Alta Eficacia acoplada a Espectrometría de Masas

En esta Memoria se ha llevado a cabo una revisión bibliográfica acerca del análisis de esfingolípidos (SL) y fosfolípidos (PL) en muestras biológicas complejas mediante Cromatografía en Capa Fina de Alta Eficacia (HPTLC)-densitometría acoplada directamente a Espectrometría de Masas, técnica que ha experimentado un desarrollo experimental importante en la última década.Tras una introducción general a los lípidos estudiados y a las técnicas cromatográficas acopladas a MS (LC y GC), se han revisado los métodos de separación HPTLC de los SL y PL, las técnicas de densitometría de barrido (UV, Vis, FL) para su detección, y las técnicas de acoplamiento a MS utilizando ionización a presión atmosférica. Estas últimas, pueden dividirse fundamentalmente en técnicas basadas en la extracción-elución automatizada de la o las bandas separadas en la placa cromatográfica, con posterior identificación estructural mediante ESI-MS, MS/MS y en técnicas de desorción-ionización sobre la placa e ionización MALDI o DESI.Cuando existen patrones adecuados, la densitometría permite la determinación cuantitativa de lípidos individuales, y la determinación semicuantitativa de las clases y subclases de SL y PL cuyos componentes pueden identificarse estructuralmente por MS. Esto se ha usado para obtener perfiles de SL y PL relacionados con el metabolismo celular, o para monitorizar el transporte de PL a través de membranas.Muchos de estos problemas se habían realizado experimentalmente utilizando procedimientos manuales de rascado y aislamiento de la banda HPTLC para su caracterización. Estos requerían mucho tiempo, daban lugar a errores experimentales y eran ineficaces a la hora de procesar una alto número de muestras. A pesar del uso cada vez más frecuente de HPTLC-densitometría-MS por su rapidez y selectividad, las posibilidades de acoplamiento no se han explorado en profundidad.<br /

Uso de tectomeros de oligoglicinas como transportadores multifuncionales

[EN] The present invention relates to the use of oligoglycine tectomers as a biocompatible vehicle for transporting hydrophobic and hydrophilic substances, characterised in that the substance is incorporated into the tectomer and released therefrom by means of pH changes in the medium. The hydrophilic substances include functionalised forms of carbon nanotubes, graphene, and graphene oxide.[ES] Uso de tectómeros de oligoglicinas como transportadores multifuncionales. La presente invención se refiere al uso de los tectómeros de oligoglicinas como vehículo biocompatible para el transporte de sustancias tanto con carácter hidrofóbico como hidrofílico, caracterizado porque esta sustancia se incorpora y libera del tectómero mediante cambios de pH del medio. Entre las sustancias con carácter hidrofílico se incluyen formas funcionalizadas de nanotubos de carbono, grafeno y óxido de grafeno.Peer reviewedConsejo Superior de Investigaciones Científicas (España), Universidad de Zaragoza, University of SurreyA1 Solicitud de patente con informe sobre el estado de la técnic